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(Biochimie du Peroxysome, Inflammation et métabolisme lipidique)

INTITULE DE STAGE M2R : caractérisation de modèles cellulaires microgliaux présentant une déficience peroxysomale

ENCADRANTS

Stéphane Savary, Professeur des Universités

Doriane Trompier, Maître de Conférences

CONTEXTE

L’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD) est une maladie neurodégénérative sévère présentant une incidence de 1 :17 000. Cette maladie est causée par une mutation dans le gène codant pour la protéine peroxysomale ABCD1. ABCD1 et son plus proche homologue, ABCD2, sont impliqués dans le transport d’acides gras à très longue chaîne (AGTLC) dans le peroxysome pour leur dégradation par b-oxydation. Le lien entre le défaut métabolique, conséquence de la mutation du gène ABCD1, et l’apparition de la maladie démyélinisante reste encore indéterminé. Les patients X-ALD ne disposent pas à ce jour de thérapie satisfaisante.

OBJECTIF GENERAL

Développer de nouvelles thérapies pharmacologiques et/ou nutritionnelles passe par la compréhension des mécanismes physiopathologiques en jeu. Cependant, l’étude de la physiopathogénèse de l’X-ALD est limitée par l’absence de modèles expérimentaux pertinents.

STRATEGIE

Etant donné que (i) la microglie est un acteur central de l’homéostasie cérébrale puisqu’elle participe au maintien de l’intégrité du réseau neuronal et myélinique et que (ii) le défaut microglial semble être l’une des causes princeps du déclenchement des leucodystrophies peroxysomales, notre laboratoire a établi un modèle d’étude microglial pour l’étude de la physiopathogénèse des leucodystrophies peroxysomales qui servira de plateforme de criblage de futures molécules thérapeutiques.

RESULTATS PRELIMINAIRES

Résultats publiés par le labo

Les modèles cellulaires microgliaux développés sont issus de la lignée murine BV-2. Ces cellules ont été rendues déficientes en transporteurs peroxysomaux d’AGTLC (ABCD1 et ABCD2) et en enzyme ACOX1 (enzyme qui contrôle la 1^ère étape de la b-oxydation peroxysomale) par édition génique CRISPR-Cas9. La validation moléculaire de ces modèles et une caractérisation préliminaire au niveau biochimique et cellulaire ont permis de confirmer les anomalies lipidiques rencontrées dans les leucodystrophies peroxysomales ainsi que des défauts d’expression de certains marqueurs microgliaux importants tels que TREM2 ^(1,2).

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 ¹ Q. Raas, F.E. Saih, C. Gondcaille, D. Trompier, Y. Hamon, V. Leoni, C. Caccia, B. Nasser, M. Jadot, F. Menetrier, G. Lizard, M. Cherkaoui-Malki, P. Andreoletti, S. Savary, A microglial cell model for acyl-CoA oxidase 1 deficiency, Biochim. Biophys. Acta 1864 (2019) 567-576.

² Q. Raas, C. Gondcaille, Y. Hamon, V. Leoni, C. Caccia, F. Ménétrier, G. Lizard, D. Trompier, S. Savary, CRISPR/Cas9-mediated knockout of Abcd1 and Abcd2 genes in BV-2 cells: novel microglial models for X-linked Adrenoleukodystrophy, Biochim. Biophys. Acta 1864 (2019) 704-714.

STAGE DE MASTER 2

Analyse transcriptomique non publiée à exploiter

Une analyse transcriptomique par RNAseq (financée par la Fondation Maladies Rares, subvention de 30 489 euros) a été réalisée sur les cellules BV-2 wt, KO_ABCD1, KO_ABCD2, KO_ABCD1_ABCD2, KO_ACOX1 traitées on non par du LPS et/ou du 25-hydroxy-cholestérol. Cette analyse a permis de mettre à jour des milliers de gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules mutantes et les cellules sauvages, nous donnant de précieuses pistes pour caractériser les conséquences du défaut peroxysomal dans la microglie, pistes qui devront être exploitées dans le cadre du stage M2R.

Impact de la déficience peroxysomale sur les fonctions microgliales

En s’appuyant sur les données obtenues par RNAseq montrant une dérégulation du groupe de gènes constituant la signature microgliale homéostatique et une dérégulation des groupes de gènes en lien avec le stress oxydant et la phagocytose, l’objectif est de caractériser l’impact des déficiences peroxysomales dans les cellules microgliales au niveau:                     

• de la signature homéostatique (déterminer les niveaux d’expression des marqueurs homéostatiques et pathologiques, WB, cytométrie en flux).
• du stress oxydant (niveaux d’expression de protéines clés pro et anti-oxydantes, WB ; niveau de production des ROS, sondes H₂DCFDA, DHE, lecteur de fluorescence sur plaque 96 puits ; niveau GSH/GSSG, kit de dosage ; dosage des activités d’enzymes anti-oxydantes ….
• de la phagocytose (niveau d’expression de protéines clés, WB ; tests fonctionnels de phagocytose de cellules (neurones, oligodendrocytes) apoptotiques et de débris de myéline ; caractérisation des anomalies du cytosquelette d’actine, microscopie à fluorescence ; étude mécanistique avec anticorps fonctionnels / inhibiteurs spécifiques pour identifier les récepteurs membranaires impliqués…)

Pendant le 1^er semestre 2020, des analyses complémentaires seront parallèlement réalisées sur des macrophages de patients X-ALD (obtenus à partir de monocytes sanguins différenciés in vitro) en collaboration avec l’équipe du Professeur Johannes Berger, Autriche. Ainsi les résultats obtenus sur la microglie de souris seront confrontés à ceux obtenus sur des macrophages de patients X-ALD.

Correction des fonctions microgliales – tests préliminaires

L’effet de molécules naturelles sera évalué au niveau du stress oxydant puisque le labo a mis au point un test de dosage des ROS sur plaques 96 puits permettant de faire du criblage. L’activité biologique des molécules issues d’huile d’argan, de raquettes de cactus, d’huile d’olives, de vin, de grenade et d’eucalyptus s’intègre au sein du consortium Franco-Allemeand NutRedOx. Il restera à mettre en évidence si les molécules sélectionnées sur la base d’un stress oxydant corrigé, permettront également de corriger les fonctions microgliales étudiées dans le cadre du stage de M2R, à savoir rétablissement de la signature homéostatique et retour à une capacité normale de phagocytose.

PERSPECTIVES

Intitulé possible de la thèse qui fera suite au M2R : modèle cellulaire de phagocytose comme outil pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’adrénoleukodystrophie liée à l’X.